科普贴:核酸药物定义大盘点


导读:

近年来,核酸药物已成为全球研发和投资的重点领域。相较于在蛋白层面进行疾病干预的传统药物,核酸药物能在遗传信息传递源头发挥作用,因此具有特异性强、基因靶点丰富、疗效持久等优点,有望开启继小分子药物和抗体药物之后的第三代药物浪潮。由于核酸类药物与小分子药物和抗体药物差异较大,各类术语会给很多刚入行的小伙伴造成困扰,本文对核酸类药物相关概念进行梳理,帮助大家了解核酸领域。

1.什么是核苷酸(Nucleotide)、核苷(Nucleoside)、核酸(nucleic acid)

  • 核苷酸(Nucleotide)由一个含氮碱基(nitrogen-containing base)、一个含五碳糖(five carbon sugar)和一个磷酸(phosphoric acid)分子组成。
    • 碱基根据母核结构分为两类,嘌呤(Purine)和嘧啶(pyrimidine),嘌呤包括腺嘌呤(adenine)和鸟嘌呤(guanine);嘧啶包括胞嘧啶(cytosine)、胸腺嘧啶(thymine)和尿嘧啶(uracil)。
    • 核糖分为两种,分别是核糖(Ribose)和脱氧核糖(deoxyribose),含核糖的核苷酸称为核糖核苷酸(ribonucleotide),是组成RNA的基本单元;含脱氧核糖的核苷酸称为脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide),是组成DNA的基本单元。
  • 核苷(Nucleoside)是核苷酸去掉磷酸分子,根据磷酸分子的数量,核苷酸(Nucleotide)可以分为核苷单磷酸(Nucleoside monophosphate)、核苷二磷酸(Nucleoside diphosphate)、核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate)。

  • 核酸(nucleic acid)是人类的遗传物质,是由核苷酸(Nucleotide)通过3',5'-磷酸二酯键连接而成的聚合物。


2.什么是核酸类药物(Nucleic Acid Drug)?
核酸类药物是指利用核酸分子的翻译或调控功能所开发的药物,由核苷酸链条通过各种剪切修饰及各种载体来发挥药理作用。小分子和抗体药物将“蛋白质”作为药物靶点,人体内许多“致病蛋白”为不可成药靶点,因此许多疾病缺乏有效的治疗手段。核酸药物有望解决“不可成药”靶点带来的未被满足的临床需求,将成为继小分子和抗体药物后的第三类主要药物。根据功能可以分为:

  • 基于DNA的,称为基因治疗,包括在体基因治疗和离体基因治疗(细胞治疗)。目前该技术比较成熟,已有几十种药物上市。
  • 基于RNA的,称为RNA药物,根据机理和分为(包括但不限于):以编码蛋白质为目的,例如mRNA;以核酸(DNA或者RNA)为靶标的,例如ASO,或者RNA干扰(siRNA或者miRNA);以蛋白质三维结构为靶向,为适配体药物。

3.什么是寡核苷酸(oligo- or oligonucleotide)?
寡核苷酸(oligo- or oligonucleotide)通常指实验室合成的DNA或者RNA片段,是由十几个到几十个核苷酸串联组成的短链核酸, 寡核苷酸广泛用于生物化学、生物学、医学分子检验、基因组学和其他分子生物学实验。
在生化实验中,寡核苷酸主要有如下两类用途:Primers引物:是一小段DNA或RNA,用于pcr扩增,作用是在扩增中作为核苷酸链延伸的起点。Probes探针:用于标记扩增产物,带可检测的荧光分子,能特异性结合扩增产物,发出荧光信号被仪器检测到。

4.什么是寡核苷酸类药物

  • 寡核苷酸类药物,也称为小核酸药物,是由十几个到几十个核苷酸串联组成的短链核酸,作用于pre-mRNA或mRNA,通过干预靶标基因表达实现疾病治疗目的。目前小核酸药物主要包括siRNA药物(small interfering RNA)和ASO药物(antisense oligonucleotide,反义核酸)。
  • 与短链的小核酸药物相对的是长链核苷酸药物(mRNA药物)

5.什么是化学修饰性核苷(modified Nucleoside)?
未经化学修饰的寡核苷酸药物成药性通常不理想,它们具有较差的PK 特性,比如稳定性差,易被核酸酶降解;极性大,很难进入细胞,分布特性差;对目标RNA 的结合亲和力不佳。为了达到临床效用,寡核苷酸必须经过化学改造。

  • 按照修饰位点分类:不同位点修饰会产生不同的药理效果

► 磷酸骨架(backbone modifications):磷酸骨架最常用的化学修饰是硫代磷酸,即将核苷酸中磷酸骨架中的一个非桥氧用硫进行替代,PS改造基本不影响核酸药物的活性,但可以抵抗核酸酶的降解,而且该改造可增强其与血浆蛋白的结合能力,降低肾脏清除速率,提高半衰期。PS是第一代ASO药物中常见的化学修饰,现在依然经常在核酸药物中使用。但经过PS改造后,核酸药物与互补核苷酸链的亲和力会变差,因此需要后续的化学修饰来改善。
► 核糖:第二代的化学修饰主要集中在核糖的结构中,对核糖结构中2位的羟基/氢进行改造,常见的改造包括2’-OME(在siRNA中应用较少)、2’-OMe、2’-F,这些改造可进一步增强对核酸酶的抵抗,并可以增强其与互补核苷酸链的结合能力。
► 核糖五元环改造:对核糖的五元环进行改造被称为第三代的化学修饰,包括LNA(locked nucleic acid)、PNA(peptide nucleic acid)、PMO(phosphoroamidate morpholino oligomer),这些改造可以进一步增强核酸药物对核酸酶的抵抗、提高亲和力和特异性等。由于PNA和PMO为电荷中性,其与血浆蛋白结合能力较弱,因此容易被清除,半衰期较短,但其可以与一些基团共价结合以提高核酸药物进入细胞的效率,包括脂类、肽类、适配体、抗体以及GalNAc等。
► 碱基:核酸药物对碱基改造的耐受性较差,但对碱基的改造也在尝试中,如胞嘧啶甲基化可提高其解链温度(melting temperature),其已经被应用在ASO药物的设计之中。
► 末端改造:为避免核苷酸链被核酸外切酶降解,需要对核苷酸链末端进行保护,包括3’端添加反式胸苷(inverted thymidine),或者在末端添加软脂酸或偶联芳香化合物。

  • 从发展历程分为三代:经过数十年的积累,寡核苷酸的化学修饰发展了3代技术。常用的化学修饰是第一代的硫代磷酸酯和第二代的甲基膦酸酯,膦酸甲酯不带电,因此比天然DNA或RNA更具亲脂性,并且可以更好地穿透细胞。后续又产生了第三代PNA、LNA等技术。


5.什么是保护性核苷(protected Nucleosides)?
在寡核苷酸合成人工合成过程中,为了防止不必要的副反应,核苷中的所有其他官能团必须通过附加一个保护基团。寡核苷酸合成的效率很大程度上取决于核苷酸磷酰胺上的保护基团, 这些保护基必须仔细地选择和选择性地并入不同的位置,例如碱基上的外环氨基,以及羟基的5’和2’位置。在寡核苷酸链组装后,所有的保护基团被去除以产生所需的寡核苷酸。

6.什么是亚磷酰胺(Phosphoramidites)?
亚磷酰胺是一种特定的保护性核苷,是目前寡核苷酸合成的标准化合物,可以在一个极其简单和极其有效的循环反应中按顺序向 DNA 链添加新的碱基。与以往的保护性核苷相比,合成效率更高,副产品更少。
上图是一个标准的标准2’-脱氧腺苷磷酰胺的结构。绿色: 在脱氧核糖上保护5’羟基的二甲氧基三甲基(DMT)基团,在酸性条件下很容易被切割。黄色: 二异丙基氨基在唑催化剂存在的情况下,在一个近乎瞬间的反应中去除磷酰胺和生长中的寡核苷酸。橙: 一种2-氰乙基,保护亚磷酸盐上的第二羟基,在温和的碱性条件下很容易除去。粉红色: 保护含氮碱基中氨基的可变基团,如2-氰乙基,在碱性条件下最终被去除。

参考阅读
《中金:核酸药物,时代已至》
Biomaterials for Polynucleotide Delivery to Anchorage-Independent Cells, DOI:10.1039/C7TB01833A
Advances in Antisense Oligonucleotide Development for Target Identification, Validation, and as Novel Therapeutics,DOI:10.4137/GRSB.S418